（一）適用范圍
本操作說(shuō)明適用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等凍存細胞的復蘇操作過(guò)程。
（二）主要試劑
復蘇培養基：含有20%滅活FBS的RPMI-1640培養基，復蘇1管細胞用量為30mL。
注：10%-20%滅活FBS均可，推薦20%滅活FBS。
IMDM，DMEM，MEM培養基均可，推薦RPMI-1640培養基。
（三）儀器設備
恒溫水浴鍋、生物安全柜（超凈工作臺）、離心機。
注：如無(wú)恒溫水浴鍋，用溫度37±3℃溫水亦可。
（四）復蘇操作流程
打開(kāi)恒溫水浴鍋，水溫設置為37℃。
將復蘇培養基孵育至37℃，在生物安全柜內，取9 mL復蘇培養基15 mL離心管。
從液氮罐或超低溫冰箱取出凍存管，用鉗子夾住凍存管蓋子邊緣，迅速放入37°C水浴中均勻快速的水平搖晃（勿將管蓋浸入水中），直至凍存管中冰晶完全融解，停止水?。s90s-120s，確定完全融解后再進(jìn)行轉移）。
用75%酒精擦拭凍存管表面以及蓋子，在生物安全柜內打開(kāi)凍存管，并把凍存管內溶液用移液器轉移到裝有9 mL復蘇培養基的15 mL離心管內（轉移時(shí)吸取和打出液體要輕柔緩慢，15s均勻吸取/打出1mL細胞懸液）。
吸取1 mL復蘇培養基洗滌凍存管，再將洗滌液轉移到15 mL離心管內，按以上步驟重復洗滌凍存管一次。輕輕吹打5-7次混勻細胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。
離心后，棄上清，加入復蘇培養基至10mL，輕輕吹打重懸細胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。
離心后，棄上清，吸去殘留液體，加入復蘇培養基（根據計數需要計算加入復蘇培養基的體積，如用血球計數板進(jìn)行計數，推薦重懸濃度5-10M/mL），輕輕吹打重懸細胞，避免氣泡。
對重懸均勻的細胞懸液進(jìn)行數量和活率測定。
（五）復蘇注意事項
為避免細胞損失太大，復蘇過(guò)程盡可能使用15mL離心管。
如果儲存凍存細胞的設備距離水浴較遠，應用干冰進(jìn)行轉移，避免凍存細胞在室溫中暴露太久。
融解搖晃過(guò)程中，不可將凍存管管蓋浸入水中，以免水進(jìn)入管中，造成污染。
水浴后不可顛倒或傾斜凍存管，以免造成細胞損失。
細胞水浴過(guò)程操作要穩定快速，轉移細胞到離心管以及吹打時(shí)操作要輕柔緩慢，切勿快速吹打剛剛復蘇的細胞。
減少棄上清后的液體殘留，以保證計數的準確性，但去上清時(shí)不可吸到管底細胞。
復蘇后細胞會(huì )在一個(gè)小時(shí)左右恢復到最佳狀態(tài)，如需對細胞進(jìn)行損傷性處理，請等待細胞活性達到最佳后進(jìn)行。
如需將細胞放置較長(cháng)時(shí)間才能進(jìn)行實(shí)驗，則加入復蘇培養基至10mL，37℃培養箱內靜置或搖床上震蕩。
應按本說(shuō)明進(jìn)行復蘇操作，且復蘇操作過(guò)程不能有時(shí)間停頓，以保證細胞活性。
